| dc.contributor.advisor | 趙知章 | zh_TW |
| dc.contributor.advisor | Chao, Chih Chang | en_US |
| dc.contributor.author (Authors) | 楊淑萍 | zh_TW |
| dc.contributor.author (Authors) | Yang, Shu Ping | en_US |
| dc.creator (作者) | 楊淑萍 | zh_TW |
| dc.creator (作者) | Yang, Shu Ping | en_US |
| dc.date (日期) | 2009 | en_US |
| dc.date.accessioned | 8-Dec-2010 02:00:36 (UTC+8) | - |
| dc.date.available | 8-Dec-2010 02:00:36 (UTC+8) | - |
| dc.date.issued (上傳時間) | 8-Dec-2010 02:00:36 (UTC+8) | - |
| dc.identifier (Other Identifiers) | G0096754006 | en_US |
| dc.identifier.uri (URI) | http://nccur.lib.nccu.edu.tw/handle/140.119/49168 | - |
| dc.description (描述) | 碩士 | zh_TW |
| dc.description (描述) | 國立政治大學 | zh_TW |
| dc.description (描述) | 生命科學研究所 | zh_TW |
| dc.description (描述) | 96754006 | zh_TW |
| dc.description (描述) | 98 | zh_TW |
| dc.description.abstract (摘要) | 神經系統裡，神經滋養因子在調控細胞分化與生存作用中扮演非常重要的角色，近年來的研究顯示 BDNF 的神經保護效果是透過細胞外訊息調控激酶 (extracellular signal-regulated kinase, ERK) 及磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K) 訊息傳遞路徑調控，然而，還有許多其他的細胞信號傳遞路徑可能參與 BDNF 的保護作用機制中。而蛋白激酶 CK2 (casein kinase 2) 是一種普遍存在於細胞且具有高度保留序列的絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶，在細胞中具有非常重要的地位。近來研究有非常多證據支持 CK2 是細胞凋亡的抑制者。此外，血清反應因子 (serum response factor, SRF) 是一種轉錄因子，會與保留序列 SRE (即 CArG box) 相結合，而此段序列過去曾在早期即時表現基因 (如 c-fos、Egr ) ，或是抗細胞凋亡基因－Mcl-1－上的啟動子被發現， SRF 調控著基因的活化，進而與細胞增生、存活、突觸活性相關聯，然而調節 SRE 調控之基因的作用機制尚未十分明瞭。因此，本論文研究主要探討在 PC12 細胞中， BDNF調節 SRE 調控轉錄作用機轉 CK2 是否參與其中? 由冷光酶活性試驗結果顯示 BDNF 會顯著地促進 SRE 的轉錄活性，並且當 CK2α 過度表現亦會促進 SRE 調控的轉錄活性，而利用小干擾 RNA 抑制內生性 CK2α 生成，則會降低 SRE 的轉錄活性，更進一步證明 CK2α siRNA 會降低 BDNF 促進 SRE 調控的轉錄活性。此外，將 CK2α 與 SRF S99A 質體一同轉染至細胞中，會減緩 CK2 促進的 SRE 啟動子轉錄活性。為了探討 CK2 調控 SRE 的轉錄活性在神經保護作用裡扮演的角色，因此，將 CK2 蛋白表現量增加是否會保護 PC12 細胞對抗Rotenone所誘發的細胞凋亡傷害?結果顯示 CK2 表現量增加會保護細胞對抗Rotenone誘導的細胞凋亡，並減緩 Rotenone 對 SRE 調控的轉錄活性降低，但是，突變型 SRF S99A 蛋白會降低 CK2α 的影響作用。這些結果顯示 BDNF 促進 SRE 調控的基因表現是會透過 CK2 訊息傳遞路徑。 | zh_TW |
| dc.description.abstract (摘要) | The neurotrophins play an important role in cell differentiation and survival of the nervous system. Among them, the neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is showed to be mediated by extracellular signal-regulated kinase (ERK) and phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) signaling pathway in the recent studies. However, other cellular signaling pathways might be involved in these effects of BDNF. Protein kinase CK2 (casein kinase 2) is a ubiquitous and highly conserved serine/threonine protein kinase and is indicated as a vital cellular role. In recent years, evidences have been mounted in support of the importance of CK2 in the suppression of apoptosis. Serum response factor (SRF) is a transcription factor binding to a consensus DNA sequence SRE (known as a CArG box) which was found in the promoters of some immediately early genes (such as c-fos, Egr) and anti-apoptotic Mcl-1 gene. The activations of SRF-regulated genes were associated with cell proliferation, cell survival and perception of synaptic activity. However, the regulatory mechanism of SRE-mediated genes is not well studied. The SRE-mediated transcription activity through CK2 signaling by BDNF treatment was studied in the PC12 cells in the present study. Results revealed that BDNF significantly increased the SRE promoter activity by luciferase report assay. The SRE-mediated transcription activity was increased by overexpression of CK2α, and the inhibition of endogenous CK2α by small interfering RNA was also shown to reduce this transcription activity. Furthermore, CK2α siRNA treatment antagonized the up-regulation effects of BDNF on SRE-mediated transcription activity. The co-transfection of CK2 and mutant SRF S99A plasmids significantly diminished up-regulatory effects of CK2 on SRE promoter activity. To test this CK2 induction in SRE-mediated transcription plays a role in neuroprotecion, we determined whether over-expression CK2 protects PC12 cells against rotenone-induced apoptosis. The results revealed that the over-expression of CK2α protected cells against rotenone-induced apoptosis and rescued the SRE-mediated transcription activity. Further, these effects of CK2α were blocked by co-transfection of mutant SRF S99A. These above results demonstrate that the up-regulation of BDNF on SRE-mediated genes is through CK2 signaling pathway. | en_US |
| dc.description.tableofcontents | 謝 誌 I 中文摘要 II 英文摘要 III 目 錄 V 圖 次 VIII 縮寫表 IX 第一章 緒論 01 第一節、神經滋養因子 (Neurotrophic factor) 01 一、Neurotrophin 的發現 01 二、大腦衍生營養因子 (brain-derived neurotrophic factor) 01 三、神經滋養因子 BDNF的生理功能與其作用方式 02 四、神經滋養因子 BDNF 與抗細胞凋亡機制的相關性 04 第二節、蛋白激酶 CK2 (Casein kinase 2) 05 一、蛋白激酶 CK (Casein kinase ) 的發現 05 二、蛋白激酶 CK2 的結構 06 三、蛋白激酶 CK2 調控作用 07 四、蛋白激酶 CK2 與細胞凋亡的相關性 08 五、蛋白激酶 CK2 對血清反應因子所調控的轉錄作用影響 10 第三節、轉錄因子—血清反應因子 (serum response factor) 11 一、轉錄因子—血清反應因子的發現 11 二、血清反應因子的結構 12 三、調控血清反應因子訊號傳遞路徑 13 四、血清反應因子與細胞凋亡之間相關性 14 第四節、細胞凋亡 (Apoptosis) 的研究 14 一、細胞凋亡歷史 14 二、細胞凋亡的機制 15 第五節、本論文之研究目的與策略 17 第二章 材料與方法 19 第一節、細胞培養 19 一、培養皿覆蓋 poly-L-lysine 19 二、細胞培養 19 三、細胞計數 20 第二節、質體 DNA 之製備 20 一、細菌培養液與固體培養基製備 20 二、大腸桿菌之轉型作用 (Transformation of E. coli) 21 三、小量質體 DNA 之製備 21 四、瓊脂膠體電泳分析 23 五、大量質體 DNA 之製備 23 六、菌種保存 24 第三節、藥物製備與細胞轉染 24 一、藥物處理 (Drug treatment) 24 二、細胞之 plasmid DNA 與 siRNA 製備 25 三、細胞之 plasmid DNA 與 siRNA 轉染 26 第四節、啟動子-冷光酶試驗 (Promoter-Luciferase Assay) 26 第五節、西方點墨法 28 一、蛋白質萃取 28 二、蛋白質濃度測定 28 三、免疫共沉澱法 (Co-immunoprecipitation) 28 四、西方點墨法 29 第六節、細胞存活試驗— MTT 試驗法 31 第七節、統計分析 31 第三章 實驗結果 32 第一節、BDNF 促進 SRE 所調控的轉錄作用 32 第二節、CK2α-WT 轉染 PC12 細胞中可調節 SRE 調控的轉錄作用 34 第三節、抑制內生性 CK2α 蛋白表現會降低 SRE 的轉錄活性 37 第四節、突變型 SRF S99A 蛋白會抑制 SRE 調控的轉錄活性 40 第五節、 CK2α 參與 BDNF 促進 SRE 調控的轉錄作用機制 43 第六節、轉染 SRF S99A 質體至 PC12 細胞中會抑制 CK2α 促進 SRE 調控的轉錄作用 45 第七節、突變型 SRF S99A 蛋白會抑制 CK2 對抗 Rotenone 誘發細胞 凋亡的能力 47 第八節、突變型 SRF S99A 蛋白會降低在 Rotenone 處理狀態下 CK2α 對 SRE 調控的基因轉錄能力 50 第四章 討論 52 第五章 結論 58 參考文獻 59 附錄 71 附錄一、pGL2-SV40 promoter 載體輿圖 71 附錄二、pcDNA3 載體輿圖 72 附錄三、pCMV-Tag 2B 載體輿圖 73 附錄四、pGL2-SV40 promoter 載體輿圖 74 附錄五、人類與老鼠之 SRF 序列 75 | zh_TW |
| dc.language.iso | en_US | - |
| dc.source.uri (資料來源) | http://thesis.lib.nccu.edu.tw/record/#G0096754006 | en_US |
| dc.subject (關鍵詞) | 腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞株 | zh_TW |
| dc.subject (關鍵詞) | 大腦衍生營養因子 | zh_TW |
| dc.subject (關鍵詞) | 蛋白激脢CK2 | zh_TW |
| dc.subject (關鍵詞) | 血清反應因子 | zh_TW |
| dc.subject (關鍵詞) | 血清反應要素 | zh_TW |
| dc.subject (關鍵詞) | 細胞凋亡 | zh_TW |
| dc.subject (關鍵詞) | 轉錄作用 | zh_TW |
| dc.subject (關鍵詞) | PC12 | en_US |
| dc.subject (關鍵詞) | BDNF | en_US |
| dc.subject (關鍵詞) | CK2 | en_US |
| dc.subject (關鍵詞) | SRF | en_US |
| dc.subject (關鍵詞) | SRE | en_US |
| dc.subject (關鍵詞) | apoptosis | en_US |
| dc.subject (關鍵詞) | transcription | en_US |
| dc.title (題名) | 神經滋養因子BDNF在PC12細胞中與蛋白激酶CK2對SRE所調控之基因轉錄作用的機制探討 | zh_TW |
| dc.title (題名) | Neurotrophic factor BDNF up-regulates SRE-mediated gene transcription through protein kinase CK2 in PC12 cells | en_US |
| dc.type (資料類型) | thesis | en |
